生物陶瓷復合聚己內酯（PCL）支架廣泛應用于骨缺損修復研究。其中，生物活性玻璃（BG）因其特有的無機非晶態結構、生物活性及骨結合特性，被認為是優異的骨類修復材料。然而，普通的BG和介孔BG孔道致密、比表面積低限制了整體支架的機械性能和生物活性，往往需要增大BG的比例來掩蓋這些缺點。3D打印可以依據骨的結構以及骨缺損類型，在成像數據和計算機輔助設計模型的輔助下，直接逐層制造高度精確的三維實體，廣泛應用于骨組織工程。聚合物和生物陶瓷的3D打印可以極大的滿足支架的性能要求，是目前研究的熱點。
 

     廣東省科學院生物與醫學工程研究所許為康團隊和遵義醫科大學附屬第二醫院瓦慶德團隊制備出高比表面積和孔徑的樹枝狀介孔結構生物活性玻璃（MBG）。將不同比例的MBG粉末與PCL混合，應用3D 打印機制備MBG/PCL支架。對復合支架進行理化性能和免疫協調成骨性能研究，從而優選具備最佳抗壓強度和成骨活性的MBG比例支架。最后，依據最佳MBG比例制備出不同纖維直徑和孔徑的MBG/PCL支架，探索纖維粗細和孔徑在支架理化性能和調控巨噬細胞（MP）向M2表型極化并促進成骨潛能上的影響。   

1、主要內容
 

MBG是由許多納米級別的小顆粒堆積組合形成的微球，玻璃微球分散性好，表面疏松多孔，孔道呈樹枝狀分布。MBG的N2吸附脫附曲線符合介孔材料的IV型等溫線，經過計算可得出生物活性玻璃微球的比表面積為457.14m2/g，孔體積為1.38cm3/g，平均孔徑為11.83nm。
 

各組支架絲徑粗細均勻，纖維方向相差90°相互交錯。支架表面存在散在孔隙，5MBG/PCL、10MBG/PCL、20MBG/PCL、30MBG/PCL支架表面可見MBG顆粒附著。從高倍鏡下看，支架表面的粗糙度隨著MBG含量的增加而增加，以30MBG/PCL最為顯著。這些粗糙面可以為細胞提供粘附的位點，更有利于引導細胞增殖、分化等行為。此外，MBG的加入改善了PCL材料的親水性，其改善程度與MBG濃度相關。   
 

各組支架均出現PCL的特征峰，其中2850-3000cm-1處–(CH2)4–為CH伸縮振動，1750cm-1處是C=O伸縮振動峰，1150-1250cm-1代表-C-O-。隨著MBG含量的增加，PCL原有的特征峰逐步降低。通過對各組支架進行熱重分析，支架剩余無機顆粒的質量與混入MBG的比例基本一致。在支架的抗壓縮性能測試中，我們可以看到隨著MBG含量的增加PCL的抗壓能力逐漸增強。以10%最顯著。但在此基礎上，隨著MBG含量的增加支架的抗壓強度逐步下降。20%和30%支架在達到抗壓峰值后迅速坍塌。這是因為PCL包裹MBG顆粒類似于“海-島”結構。我們推測，當MBG（“島”組分）含量進一步增大時，對PCL（“海”組分）的整體連接性能產生了不利的影響，進而降低支架的最大抗壓強度。同時，較大比例的MBG在PCL中團聚，使得抗壓形變過程中受力不均導致支架整體坍塌。   
 

BMSCs在各組支架上增殖的OD值隨著培養時間的增加而增加，10MBG/PCL組增殖活性顯著優于其他組。在成骨分化早期，5MBG/PCL、10MBG/PCL、20MBG/PCL、組成骨基因（ALP、OPN、BMP2）的表達量顯著高于0MBG/PCL組，而30MBG/PCL與0MBG/PCL組差異不顯著。在COLI的表達中則是含MBG的支架顯著高于純PCL組。值得注意的是，相比其他組，10MBG/PCL組支架在上述基因的表達上調中最為顯著。在RUNX2的表達中，10MBG/PCL組同樣顯著高于0MBG/PCL和5MBG/PCL組，而與20MBG/PCL、30MBG/PCL無顯著差異。成骨誘導14天后，相比其他組，10MBG/PCL組仍最顯著地上調OPN、RUNX2、BMP2、COLI的表達。在ALP表達中，10MBG/PCL和20MBG/PCL顯著優于0MBG/PCL組，同時10MBG/PCL＞30MBG/PCL，而其余各組之間卻無顯著差異。將BMSCs與支架共培養，成骨誘導7天進行ALP定量分析，10MBG/PCL組支架ALP表達量最高，而其余各組之間差異不顯著，這也與ALP染色的結果一致。綜上所述，在PCL材料中摻入MBG，可以增強其體外成骨性能，其中以10MBG/PCL支架的促BMSCs成骨分化性能最為優異。研究表明，BG釋放的Si2+、Ca2+、P5+離子在與BMSCs等細胞接觸過程中會調控細胞周期并上調或激活成骨基因的表達，且納米尺寸的BG具備更強的生物活性，尺寸較小的生物玻璃促使細胞由G0/G1期向S/G2期能力更強，而尺寸大的生物玻璃使得更大比例的細胞保持在G0/G1期。這可能是含量20%、30%MBG支架增殖活性顯示較低的原因（MBG在PCL表面團聚）。
 

10MBG/PCL支架上調巨噬細胞M2型基因（CD206、ARG）表達以及抑制M1型基因（TNF-α、IL-1β）表達的性能最顯著。相比與純PCL支架，MBG賦予了PCL一定的促MP向M2表型極化的能力。為了評價支架介導MP的M2極化促進BMSCs成骨分化的潛能，在各組支架中加入相應的MP條件培養基進行促BMSCs成骨分化研究。MP條件培養基下10MBG/PCL組上調成骨相關基因（ALP、RUNX2、OPN、COLI、BMP-2）的表達最顯著，ALP染色和定量同樣如此。我們推測這與MBG的劑量相關，更高濃度的MBG可能會延長MP向M1極化的過程，表達更多的M1表型基因TNF-α和IL-1β，不利于炎癥的清除。
 

以10MBG/PCL支架為模板設定3D打印參數。打印統一孔徑500um，不同纖維直徑（300um、500um、800um）的三組支架，分別標記為F300、F500、F800。支架的親水性和抗壓強度以F500最佳。當纖維直徑減少200um，支架的抗壓性能則降低15.72MPa。纖維直徑增加300um，支架的抗壓性能則上升4.28MPa。更粗的纖維增加了支架的受力面積，因此整體表現為支架的抗壓能力隨著纖維的增粗而增強。三組支架的孔隙率則與抗壓性能相反，相比F500，F300的孔隙率增加1.73%，而F800則下調了6.06%。  
 

打印統一纖維直徑500um，不同孔徑（200um、500um、800um）的支架，分別標記為P200、P500、P800。P500的接觸角最大，而P200和P800的接觸角無顯著差異。支架的孔徑越大孔隙率越高，同時，支架的抗壓強度隨著孔徑增大而下降。這可能是孔徑的增寬降低了支架的受力面積，進而導致抗壓能力的減弱。   
 

BMSCs能在不同纖維直徑支架上定植，其中F500的熒光數量最多，其次為F800，這與細胞增殖的OD值梯度相符。這是由于纖維越細單位面積內絲徑數目越多，能為細胞提供更多的粘附位點。但是，由于F300相對弧度較大，反而最不利于細胞早期粘附。細胞粘附的差異同樣反應在成骨性能上，F500上調成骨基因（ALP、RUNX2、OPN、COLI、BMP-2）的表達最為顯著，F300次之，最低的是F800。然而，在ALP染色和定量中雖然仍以F500最佳，但是F800、F300卻無顯著差異。
 

在炎癥基因的表達中，較粗的纖維和較大的孔徑似乎更有利于細胞外基質的分泌和沉積，傾向于修復表型M2基因（CD206、ARG）的表達。F500顯著抑制了M1型基因（TNF-α、IL-1β）的表達，F300卻顯著上調M1型基因，然而在第3天的TNF-α表達中F800＞F300。然而，F300誘導MP極化為M2的性能要優于F800，這可能是同等面積下，F300的纖維交叉較多，有利于MP的拉伸，促進M2極化。在MP條件培養基的介導下，在各個時間點上，F500促進成骨基因（ALP、OPN、BMP-2、COLI）的表達上調最為顯著。在RUNX2的表達中，第7天F500顯著高于F800，與F300無顯著差異。第14天，F300優于F800，但F500與其余兩組未表現出差異。F300和F800在ALP的染色和定量中未出現顯著差異，F500能顯著的促進ALP分泌。總的來說，在免疫調控成骨性能上，F500>F300>F800。
 

      將支架與BMSCs共培養，在第1天的增殖中，P800的OD最高，P200與P500無顯著差異。而在3、7天，P500的細胞增殖活性顯著上調。總體上，BMSCs的增殖活性P500>P800>P200。在共培養三天后的熒光染色中，我們同樣可以看到這樣的趨勢。在第7天的ALP染色和定量中，我們可以看到P500具有最顯著的ALP表達效果。在成骨基因ALP、OPN、RUNX2、BMP-2、COLI的表達中，P500的上調性能最顯著。較小的孔徑不利于成骨組織表型的功能分化，足夠大（＞250um）的孔徑利于骨的礦化。而P500具備最顯著的成骨潛能，這可能是纖維直徑500um、孔徑500um的支架處于理化性能、細胞粘附和營養物質交換之間最佳的平衡狀態。   
 

    如圖11所示，大孔徑似乎更能促進MP向M2表型極化。相比P300，P500和P800顯著上調CD206和ARG的表達，同時，第一天的ARG表達P500＞P800，而其他情況下P500和P800無顯著差異。P200誘導炎癥基因（TNF-α、IL-1β）的表達最顯著，P800次之，P500顯示出顯著的抑制效果。P200和P800促MP極化的能力弱于P500，這可能也是支架性能和細胞滲透未達到最佳平衡所致。在MP條件培養基的介導下，在各個時間點上，P500顯著上調成骨基因的表達，P800的體外免疫成骨性能要優于P200。同樣的，在ALP的染色和定量中，P500表現最顯著的活性。   

2、總結與展望
我們合成了高活性的MBG，提升了PCL支架整體的抗壓性能和生物活性。其中10MBG/PCL具備最高的抗壓強度（約是純PCL支架的2倍）和最優異的體外誘導成骨活性。10MBG/PCL支架顯著的抑制了MP的M1表型極化過程，上調M2抗炎表型基因。進一步探索發現，支架的理化性能和成骨活性同時受纖維粗細和孔徑大小的影響。然而，支架的孔徑大小比纖維粗細更能誘導MP的極化。總之，纖維直徑500um、孔徑500um的10MBG/PCL支架具備最佳的成骨潛能，能顯著誘導MP向M2表型極化，且該組最能介導巨噬細胞極化進而誘導BMSCs成骨分化，形成利于骨再生的免疫微環境。本研究向BG復合PCL支架性能的探索邁進了一步，為骨移植材料的研發提供了新的思路。

參考資料：https://doi.org/10.36922/ijb.3551   

(責任編輯：admin)

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